Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒 分子生物試劑
Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒
如要對(duì)基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行可靠比較,則需從同一樣本中純化DNA和RNA。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit使用的溶解方法,從福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣本中純化DNA和RNA。純化產(chǎn)物適用于real-time PCR和焦磷酸測(cè)序等應(yīng)用。
從FFPE樣本中純化DNA和RNA。
[A] 從多個(gè)大鼠FFPE組織樣本中純化基因組DNA并儲(chǔ)存于室溫。使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(專(zhuān)用于從FFPE樣本中純化DNA的試劑盒,作為對(duì)照)進(jìn)行純化,兩種試劑盒都含有RNase消化試劑。采用吸光度測(cè)定方法檢測(cè)每個(gè)20 μm組織切片的DNA產(chǎn)量。[B] 從多個(gè)大鼠FFPE組織樣本中純化RNA并儲(chǔ)存于室溫。使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或RNeasy FFPE Tissue Kit(專(zhuān)用于從FFPE樣本中純化DNA的試劑盒,作為對(duì)照)進(jìn)行純化。采用吸光度測(cè)定方法檢測(cè)每個(gè)10 μm組織切片的RNA產(chǎn)量。從FFPE組織中純化DNA或RNA時(shí),AllPrep Kit的表現(xiàn)與專(zhuān)用的純化試劑盒表現(xiàn)相當(dāng)。
對(duì)預(yù)擴(kuò)增的cDNA進(jìn)行芯片分析。
使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit從人類(lèi)乳腺FFPE組織中純化總RNA。然后使用RT2 FFPE PreAMP技術(shù)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用Human Cell Cycle RT2 Profiler PCR Array,通過(guò)real-time PCR進(jìn)行基因表達(dá)分析,將腫瘤樣本與非腫瘤樣本進(jìn)行對(duì)比。ΔΔCT分析顯示:腫瘤樣本中的基因表達(dá)與非腫瘤樣本的基因表達(dá)存在x倍的差異。
對(duì)FFPE樣本中的DNA和RNA進(jìn)行可靠擴(kuò)增。
使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或?qū)S糜趶腇FPE樣本中純化DNA或RNA的試劑盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 或RNeasy FFPE Kit,作為對(duì)照)從大鼠FFPE組織中純化獲得[A] DNA 和[B]、[C] RNA。在ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System上,使用[A] QuantiTect SYBR® Green PCR Kit對(duì)78 bp的Prnp基因擴(kuò)增子進(jìn)行Real-time PCR分析,或是用[B]、[C] QuantiTect SYBR® Green RT-PCR Kit對(duì)Jun原癌基因表達(dá)進(jìn)行real-time RT-PCR分析。AllPrep Kit和另外兩個(gè)專(zhuān)用試劑盒的CT值相當(dāng),表明三種試劑盒純化DNA或RNA的效率相當(dāng)。[C] 此外,在沒(méi)有逆轉(zhuǎn)錄酶(–RT)的條件下分析了Jun基因的表達(dá)。脾臟是富含DNA的組織,其擴(kuò)增曲線平坦,說(shuō)明純化的RNA中不含基因組DNA。
AllPrep DNARNA FFPE樣本純化步驟。
Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit專(zhuān)為從FFPE樣本中同時(shí)純化基因組DNA和總RNA而設(shè)計(jì)。該試劑盒可使用同一樣本純化DNA和RNA,而非像其他純化方法那樣,需將樣本分為兩份再分別進(jìn)行純化操作。如將樣本分為兩份分別純化DNA和RNA,其純化出的DNA和RNA來(lái)自不同的細(xì)胞群落,可能具有不同性質(zhì)特征。從同一樣本中同時(shí)純化DNA和RNA可減少浪費(fèi),因?yàn)镕FPE樣本是十分珍貴的樣本,通常很難恢復(fù)且樣本量少。
由于固定和包埋,F(xiàn)FPE樣本中的核酸通常都嚴(yán)重片段化,核酸的分子量通常小于從新鮮或冷凍樣本中分離出的核酸的分子量。從同一FFPE樣本中分離DNA和RNA面臨著很大困難:片段化的DNA長(zhǎng)度短,且部分是單鏈結(jié)構(gòu);因此其更像RNA,而非完整的DNA。片段化DNA這一特性使得用物理方法分離DNA和RNA十分困難。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit使用的溶解方法,從同一個(gè)FFPE樣本中分別釋放DNA和RNA。
盡管標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制分析(如凝膠電泳或芯片分析方法)無(wú)法檢測(cè)到甲醛的化學(xué)修飾,但其對(duì)酶分析有嚴(yán)重干擾。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit已經(jīng)過(guò)優(yōu)化,可zui大程度上逆轉(zhuǎn)甲醛化學(xué)修飾,而不引起DNA和RNA的進(jìn)一步降解。
盡管AllPrep DNA/RNA FFPE Kit已經(jīng)過(guò)優(yōu)化,可zui大程度上逆轉(zhuǎn)福爾馬林化學(xué)修飾,而不引起DNA和RNA的進(jìn)一步降解;但從FFPE樣本中純化獲得的核酸不應(yīng)該用于需要大分子量DNA或完整長(zhǎng)度RNA的下游應(yīng)用。一些應(yīng)用可能需要進(jìn)行化學(xué)修飾后,再使用片段化核酸(如:設(shè)計(jì)PCR和RT-PCR的小擴(kuò)增子)。在cDNA合成中,應(yīng)使用基因特異性引物,而非oligo-dT引物。如果無(wú)法使用基因特異性引物,則可使用任意引物。
特點(diǎn) | 參數(shù) |
Applications | PCR, qPCR, real-time RT-PCR, microarray |
Elution volume | RNA: 14-30µl ; DNA: 30-100µl |
Format | Spin column |
Main sample type | FFPE tissue samples |
Number of preps per run | 50 |
Processing | Manual (centrifugation) |
Purification of total RNA, miRNA, poly A+ mRNA, DNA or protein | RNA (miRNA) and DNA |
Sample amount | max. 4*10 µm sections or 2*20 µm sections |
Technology | Silica technology |
Time per run or per prep | 6h for 10 samples, including sectioning |
Yield | Varies |